Čo je LL-37?

LL-37 je najviac skúmaný ľudský antimikrobiálny peptid. Ide o 37-aminokyselinový katiónový peptid, ktorý je prirodzene produkovaný v našom tele, najmä v polymorfonukleárnych leukocytoch, koži, kostnej dreni, neutrofiloch a makrofágoch. Objavený bol koncom 90. rokov počas výskumu mechanizmov vrodenej imunity. LL-37 vzniká štiepením väčšej molekuly nazývanej katelicidín, ktorá slúži ako obranná línia proti mikroorganizmom.

Tento peptid dokáže ničiť baktérie, vírusy, huby alebo plesne, a zároveň znižovať zápal. Okrem toho podporuje hojenie tkanív a rast ciev, čo z neho robí zaujímavý nástroj v boji proti chronickým zápalom, autoimunitným ochoreniam či rakovine. Vzhľadom na jeho schopnosť pôsobiť aj proti multirezistentným baktériám je LL-37 študovaný aj ako nádejná alternatíva k tradičným antibiotikám.

Má totiž schopnosť priamo narušiť bakteriálne membrány a zároveň stimulovať imunitný systém. V rámci skúmania týchto účinkov bol v E. coli pomocou vlastného expresného systému produkovaný rekombinantný peptid GLL-37, a to vo vysokých množstvách. Napriek tomu však nevykazoval antibakteriálnu aktivitu porovnateľnú so syntetickým LL-37. Príčinou jeho neúčinnosti bola odlišná sekundárna štruktúra – GLL-37 nadobudol formu α-helixu, ktorá mu bráni efektívne interagovať s bakteriálnymi membránami. Štúdia potvrdzuje, že pre účinné narušenie bakteriálnej membrány je nevyhnutná prítomnosť náhodnej špirály v štruktúre peptidu, akú má LL-37.

[1]

Účinky potvrdené výskumom

1. LL-37 a zápalové ochorenia

Aj keď je LL-37 primárne známy ako antimikrobiálny peptid, čoraz viac dôkazov poukazuje na jeho zásadnú úlohu v patofyziológii zápalových a autoimunitných ochorení, ako sú psoriáza, lupus erythematosus, reumatoidná artritída či ateroskleróza. LL-37 vykazuje rôznorodé imunomodulačné účinky v závislosti od zápalového mikroprostredia. Medzi jeho pozorované účinky patrí napríklad zvýšená produkcia interferónu alfa (IFN-α), interleukínu IL-18, zníženie apoptózy keratinocytov, zmena chemotaxie neutrofilov a eozinofilov či down-regulácia signalizácie cez Toll-like receptor 4 (TLR4). Zaujímavé je aj pozorované zníženie objemu aterosklerotických plakov v súvislosti s jeho aktivitou.

Experimentálne štúdie ukazujú, že LL-37 ovplyvňuje imunitnú odpoveď rôznymi spôsobmi v závislosti od aktivačného stavu imunitných buniek. Napríklad T-lymfocyty reagujú na LL-37 prozápalovo, ak nie sú aktivované, no ich zápalová aktivita sa znižuje po ich aktivácii. Tento paradoxný efekt poukazuje na homeostatickú schopnosť LL-37 regulovať intenzitu imunitnej odpovede podľa kontextu. To vytvára predpoklad, že LL-37 môže prispievať k ochrane pred nadmernou imunitnou reakciou v prostredí chronického zápalu a autoimunitných ochorení, a nie ju len zhoršovať, ako sa predtým predpokladalo.

Na molekulárnej úrovni LL-37 ovplyvňuje diferenciáciu monocytov na makrofágy a podporuje zápalový M1 fenotyp. Prítomnosť LL-37 znižuje expresiu protizápalového cytokínu IL-10 a zvyšuje produkciu IL-12p40. Zároveň zosilňuje signalizáciu sprostredkovanú interleukínom IL-1β. Napriek tomu vykazuje LL-37 aj výrazné protizápalové účinky – napríklad inhibíciou odpovedí na cytokíny IFN-γ, TNF-α, IL-4 a IL-12. LL-37 navyše pôsobí chemotakticky prostredníctvom FPR2 receptora, čím indukuje migráciu neutrofilov, eozinofilov a keratinocytov, a podporuje regeneráciu tkanív. Je schopný aktivovať transkripciu chemokínu CXCL8 a stimulovať sekréciu MCP-1/CCL2 i TGF-β, čím významne zasahuje do regulácie zápalu a hojenia rán.

[2], [3]

2. LL-37 a antimikrobiálny účinok

LL-37 je kľúčovou zložkou vrodeného imunitného systému kože, ktorý sa aktivuje ako jedna z prvých obranných línií v prípade infekcie. Zatiaľ čo v zdravej pokožke sú hladiny LL-37 a ďalších antimikrobiálnych peptidov, ako je ľudský beta-defenzín 2 (HBD-2), minimálne, pri zápalových ochoreniach ako psoriáza dochádza k ich výraznej akumulácii. Imunohistochemická analýza kožných biopsií preukázala vysokú expresiu LL-37 a HBD-2 v epidermis pacientov so psoriázou, na rozdiel od signifikantne nižších hladín v léziách pacientov s atopickou dermatitídou. Tieto rozdiely boli potvrdené aj pomocou imunodot blot, Western blot a kvantitatívnej RT-PCR, pričom psoriatické lézie vykazovali podstatne vyššiu expresiu mRNA pre oba peptidy. Testy antimikrobiálnej aktivity ukázali, že kombinácia LL-37 a HBD-2 má synergický účinok pri likvidácii Staphylococcus aureus. Tieto výsledky naznačujú, že nedostatočná produkcia antimikrobiálnych peptidov, vrátane LL-37, môže byť významným faktorom zvyšujúcim náchylnosť pacientov s atopickou dermatitídou na bakteriálne kožné infekcie.

Peptid pôsobí najmä väzbou na lipopolysacharid (LPS), kľúčovú súčasť vonkajšej membrány gramnegatívnych baktérií, čím narúša ich integritu a prejavuje silné antimikrobiálne účinky. Tento mechanizmus z neho robí sľubného kandidáta na liečbu závažných bakteriálnych infekcií a sepsy. Výskumy ukázali, že aj fragmenty LL-37 s odstránenými hydrofóbnymi N-koncovými aminokyselinami (fragmenty 106 a 110) si zachovávajú antimikrobiálnu a LPS-neutralizačnú aktivitu, pričom sú menej toxické pre ľudské bunky a ich účinnosť nie je ovplyvnená prítomnosťou séra. Tieto výsledky naznačujú potenciál modifikovaných foriem LL-37 ako terapeutických látok s nižšou cytotoxicitou.

LL-37 má antimikrobiálny účinok nielen na gramnegatívne, ale aj na grampozitívne baktérie, pričom posilňuje účinok lyzozýmu proti Staphylococcus aureus. Okrem svojej schopnosti viazať a neutralizovať LPS má potenciál v liečbe sepsy, no jeho klinické využitie obmedzuje toxicita a znížená účinnosť v prítomnosti séra. Štúdie ukázali, že modifikované fragmenty LL-37 (106 a 110) si zachovávajú antimikrobiálnu aktivitu a LPS-neutralizačný účinok, pričom sú menej toxické a necitlivo reagujú na inhibíciu sérom, čo z nich robí perspektívne terapeutické alternatívy.

[4], [5], [6]

3. LL-37 a pľúcne ochorenia

Lipopolysacharid (LPS), prítomný nielen v baktériách, ale aj v rôznych environmentálnych organizmoch vrátane plesní, predstavuje významný prozápalový stimul, ktorý po inhalácii zohráva kľúčovú úlohu v patogenéze respiračných ochorení, ako sú astma, CHOCHP či hypersenzitívna pneumonitída. V reakcii na LPS bunky epitelu dýchacích ciest produkujú antimikrobiálne peptidy, vrátane LL-37, ktorý okrem baktericídneho účinku vykazuje viaceré imunomodulačné vlastnosti, ako je stimulácia angiogenézy, proliferácie epitelových buniek, uzatvárania rán a uvoľňovania cytokínov. LL-37 zároveň neutralizuje LPS, čím znižuje jeho patogénny potenciál. Vzhľadom na tieto vlastnosti sa skúma inhalačné podávanie LL-37 ako terapeutická možnosť pri syndróme toxického organického prachu a iných zápalových ochoreniach pľúc.

Jediný katelicidín exprimovaný u ľudí, zohráva významnú úlohu nielen v antimikrobiálnej obrane, ale aj v procesoch opravy a regenerácie epitelu dýchacích ciest. Štúdie preukázali, že tento peptid podporuje proliferáciu a migráciu epitelových buniek, čím významne prispieva k uzatváraniu rán a obnoveniu integrity tkaniva. LL-37 stimuluje hojenie mechanicky vyvolaných lézií v epitelových bunkách dýchacích ciest, pričom jeho účinok závisí od prítomnosti séra a je sprostredkovaný signálnymi dráhami zahŕňajúcimi receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR), receptory spojené s G-proteínom a MAP/ERK kinázovú dráhu. Okrem toho LL-37 podporuje angiogenézu, čo zvyšuje dodávku živín do novotvoreného tkaniva. Tieto vlastnosti naznačujú, že LL-37 pôsobí ako homeostatický regulátor v dýchacích cestách, kde nielen moduluje imunitnú odpoveď, ale zároveň prispieva k udržiavaniu štrukturálnej a funkčnej integrity pľúcneho epitelu.

[7], [8]

4. LL-37 pri artritíde

Výskumy zamerané na úlohu katelicidínu LL-37 v patogenéze reumatoidnej artritídy (RA) poukazujú na jeho výraznú nadreguláciu v synoviálnych membránach postihnutých kĺbov. Zvýšená expresia bola zaznamenaná najmä v neutrofilných granulocytoch, makrofágoch a osteoklastoch, čo naznačuje úzke prepojenie medzi prítomnosťou peptidu a zápalovým procesom. Podobné výsledky boli potvrdené aj v experimentoch na potkanoch s pristane-indukovanou artritídou, kde sa pozorovala súvislosť medzi zvýšenou hladinou rCRAMP (ekvivalent LL-37) a akumuláciou granulocytov, zvýšenou apoptózou, hladinami IFN-α a tvorbou auto-protilátok. Napriek týmto pozorovaniam však nie je jednoznačne preukázané, že by katelicidíny boli priamou príčinou ochorenia. Ich zvýšená prítomnosť môže byť skôr dôsledkom zápalovej odpovede ako pokus organizmu o reguláciu zápalu.

Ďalšie štúdie naznačujú, že absencia LL-37 alebo jeho myšacieho analógu CRAMP neovplyvňuje priebeh reumatoidnej artritídy ani systémového lupus erythematosus (SLE) v zvieracích modeloch. U CRAMP-deficientných myší nedošlo k významným rozdielom v sérových hladinách cytokínov, autoprotilátok či expresii interferónom I stimulovaných génov v porovnaní s kontrolnými jedincami. Rovnako neboli pozorované rozdiely v závažnosti zápalu, poškodení chrupavky či erózii kostí. Tieto výsledky podporujú hypotézu, že reaktivita voči LL-37 v autoimunitných ochoreniach je epifenoménom, vyplývajúcim z masívnej nadprodukcie peptidu v postihnutých tkanivách, pričom samotný peptid nezohráva kauzálnu úlohu v rozvoji ochorenia. Zároveň je pravdepodobné, že iné kationické antimikrobiálne peptidy môžu funkčne kompenzovať jeho neprítomnosť.

Experimentálne štúdie na myších modeloch reumatoidnej artritídy (RA) preukázali, že peptidy odvodené od ľudského katelicidínu LL-37, najmä peptid IG-19, majú významný terapeutický potenciál. Podávanie IG-19 do postihnutých kĺbov viedlo k zmierneniu klinických prejavov artritídy, zníženiu hladín protilátok proti kolagénu typu II, ako aj k zníženej infiltrácii zápalových buniek a ochrane chrupavkového tkaniva. Tieto účinky naznačujú, že LL-37 a jeho deriváty môžu plniť ochrannú funkciu v priebehu zápalového ochorenia, pravdepodobne vďaka svojim protizápalovým a imunoregulačným vlastnostiam. Na rozdiel od iných katelicidínových derivátov, ako napríklad IDR-1018, bol účinok IG-19 špecifický a biologicky účinný, čo podčiarkuje význam sekvenčne a funkčne presne navrhnutých peptidov pri vývoji alternatívnych terapií zápalových ochorení.

Ďalšie poznatky naznačujú, že LL-37 a IG-19 tlmia zápal sprostredkovaný interleukínom-32 (IL-32), cytokínom úzko spojeným so závažnosťou RA. In vitro štúdie na ľudských periférnych mononukleárnych bunkách (PBMC) preukázali, že tieto peptidy významne potláčajú produkciu prozápalových cytokínov, ako sú TNF-α a IL-1β, pričom zároveň zvyšujú sekréciu protizápalového IL-1RA. Mechanisticky sa ukázalo, že LL-37 a IG-19 ovplyvňujú signálne dráhy sprostredkované Src kinázou a aktivujú duálnu fosfatázu MKP-1, známu ako negatívny regulátor zápalu. Tieto zistenia poskytujú silný základ pre vývoj cielenej peptidovej terapie, ktorá by mohla efektívne regulovať zápal bez kompromitovania prirodzenej imunitnej obrany, čo je zásadné pri liečbe autoimunitných ochorení, ako je RA.

Výskum tiež ukazuje, že Toll-like receptor 3 (TLR3) hrá významnú úlohu v rozvoji a zhoršovaní reumatoidnej artritídy (RA) prostredníctvom aktivácie fibroblastov synoviálnej výstelky (FLS), najmä keď sú stimulované T bunkami. Zvýšená expresia TLR3 vedie k zvýšenej produkcii zápalových cytokínov, ako IL-6 a IFN-β, a matrix metaloproteináz, čím podporuje zápal a poškodzovanie kĺbového tkaniva. Aktivácia TLR3 poly(I:C) synergicky zhoršila artritídu u potkanov, zatiaľ čo jej blokovanie viedlo k zníženiu zápalových prejavov. LL-37, hostiteľský obranný peptid, ktorý môže mať pro- aj protizápalové účinky, sa viaže na iné Toll-like receptory, ako TLR4, a preukázal schopnosť selektívne tlmiť zápalové reakcie makrofágov. V experimentoch znížil produkciu TNF-α a NO v polarizovaných makrofágoch bez toho, aby narušil ich fagocytárnu alebo antimikrobiálnu aktivitu. To naznačuje, že LL-37 by mohol mať terapeutický potenciál pri artritíde, najmä v súvislosti s jeho schopnosťou cieleného tlmenia zápalových reakcií bez oslabenia kľúčových funkcií imunitných buniek, hoci jeho konkrétny účinok v kontexte TLR3 ešte nie je dostatočne preskúmaný.

[9] - [16]

5. Výskum LL-37 v súvislosti s rakovinou čriev

Štúdium účinkov LL-37 v kontexte rakoviny priniesol zmiešané výsledky – zatiaľ čo pri niektorých typoch nádorov, ako je rakovina pľúc, prsníka či prostaty, LL-37 podporuje nádorový rast, pri iných, napríklad pri rakovine hrubého čreva, žalúdka, hematologických malignitách či spinocelulárnom karcinóme ústnej dutiny, vykazuje protirakovinové účinky. Tieto rozdielne reakcie sú pravdepodobne výsledkom aktivácie rôznych membránových receptorov na povrchu rakovinových buniek, ktoré sprostredkujú tkanivovo špecifickú odpoveď. Zvlášť zaujímavý je vzťah LL-37 k vitamínu D, ktorý indukuje jeho expresiu a tým podporuje protinádorovú aktivitu makrofágov spojených s nádorom (TAM) vrátane zvýšenia cytotoxicity závislej od protilátok (ADCC). Tento mechanizmus môže vysvetľovať pozitívny vplyv vitamínu D na zníženie rizika rakoviny gastrointestinálneho traktu, a naznačuje, že LL-37 môže zohrávať dôležitú ochrannú úlohu pri rakovine čriev a žalúdka.

[17]

6. LL-37 pri angiogenéze

Peptid LL-37 zohráva významnú úlohu aj pri podpore rastu krvných ciev (angiogenéze). Výskum ukázal, že LL-37 stimuluje syntézu prostaglandínu E2 (PGE2) v endotelových bunkách cez dráhu cPLA2→COX-1→PGE2, čo vedie k aktivácii receptoru EP3 a následnej angiogenéze. Táto syntéza je závislá na dávke LL-37 a dosahuje vrchol približne po 4 hodinách. Na rozdiel od iných mechanizmov zápalu sa v tomto procese zapája najmä cyklooxygenáza COX-1, nie COX-2, čo potvrdzuje citlivosť na inhibíciu aspirínom. Táto dráha predstavuje dvojsečný meč – podporuje hojenie rán a regeneráciu tkanív, ale zároveň môže napomáhať patologickému rastu ciev, napríklad v nádoroch. Preto sa os LL-37/COX-1/PGE2/EP3 javí ako potenciálny cieľ pre terapeutické zásahy pri ochoreniach spojených s nadmernou alebo nedostatočnou angiogenézou.

[18] [19]

Zdroje

1. Antonín Pavelka, Lukáš Vacek, Adam Norek, Šárka Kobzová, Lubomír Janda, „Recombinant production of human antimicrobial peptide LL-37 and its secondary structure“, Volume 79, pages 263–273, (2024)
2. J. M. Kahlenberg and M. J. Kaplan, “Little peptide, big effects: the role of LL-37 in inflammation and autoimmune disease,” J. Immunol. Baltim. Md 1950, vol. 191, no. 10, Nov. 2013.
3. D. S. Alexandre-Ramos et al., “LL-37 treatment on human peripheral blood mononuclear cells modulates immune response and promotes regulatory T-cells generation,” Biomed. Pharmacother. Biomedecine Pharmacother., vol. 108, pp. 1584–1590, Dec. 2018.
4. P. Y. Ong et al., “Endogenous antimicrobial peptides and skin infections in atopic dermatitis,” N. Engl. J. Med., vol. 347, no. 15, pp. 1151–1160, Oct. 2002.
5. C. D. Ciornei, T. Sigurdardóttir, A. Schmidtchen, and M. Bodelsson, “Antimicrobial and chemoattractant activity, lipopolysaccharide neutralization, cytotoxicity, and inhibition by serum of analogs of human cathelicidin LL-37,” Antimicrob. Agents Chemother., vol. 49, no. 7, pp. 2845–2850, Jul. 2005.
6. X. Chen et al., “Synergistic effect of antibacterial agents human β-defensins, cathelicidin LL-37 and lysozyme against Staphylococcus aureus and Escherichia coli,” J. Dermatol. Sci., vol. 40, no. 2, pp. 123–132, Nov. 2005.
7. M. Golec, “Cathelicidin LL-37: LPS-neutralizing, pleiotropic peptide,” Ann. Agric. Environ. Med. AAEM, vol. 14, no. 1, pp. 1–4, 2007.
8. R. Shaykhiev et al., “Human endogenous antibiotic LL-37 stimulates airway epithelial cell proliferation and wound closure,” Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., vol. 789, no. 5, pp. L842-848, Nov. 2005.
9. M. H. Hoffmann et al., “The cathelicidins LL-37 and rCRAMP are associated with pathogenic events of arthritis in humans and rats,” Ann. Rheum. Dis., vol. 72, no. 7, pp. 1239–1248, Jul. 2013.
10. D. Kienhöfer et al., “No evidence of pathogenic involvement of cathelicidins in patient cohorts and mouse models of lupus and arthritis,” PloS One, vol. 9, no. 12, p. e115474, 2014.
11. L. N. Y. Chow et al., “Human cathelicidin LL-37-derived peptide IG-19 confers protection in a murine model of collagen-induced arthritis,” Mol. Immunol., vol. 57, no. 2, pp. 86–92, Feb. 2014.
12. K.-Y. G. Choi, S. Napper, and N. Mookherjee, “Human cathelicidin LL-37 and its derivative IG-19 regulate interleukin-32-induced inflammation,” Immunology, vol. 143, no. 1, pp. 68–80, Sep. 2014.
13. W. Zhu et al., “Arthritis is associated with T-cell-induced upregulation of Toll-like receptor 3 on synovial fibroblasts,” Arthritis Res. Ther., vol. 13, no. 3, p. R103, Jun. 2011.
14. K. L. Brown et al., “Host defense peptide LL-37 selectively reduces proinflammatory macrophage responses,” J. Immunol. Baltim. Md 1950, vol. 186, no. 9, pp. 5497–5505, May 2011.
15. J.-M. Otte et al., “Effects of the cathelicidin LL-37 on intestinal epithelial barrier integrity,” Regul. Pept., vol. 156, no. 1–3, pp. 104–117, Aug. 2009.
16. J.-M. Otte et al., “Human beta defensin 2 promotes intestinal wound healing in vitro,” J. Cell. Biochem., vol. 104, no. 6, pp. 2286–2297, Aug. 2008.
17. X. Chen et al., “Roles and Mechanisms of Human Cathelicidin LL-37 in Cancer,” Cell. Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol., vol. 47, no. 3, pp. 1060–1073, 2018.
18. Salvado M. Dolores, Di Gennaro Antonio, Lindbom Lennart, Agerberth Birgitta, and Haeggström Jesper Z., “Cathelicidin LL-37 Induces Angiogenesis via PGE2–EP3 Signaling in Endothelial Cells, In Vivo Inhibition by Aspirin,” Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., vol. 33, no. 8, pp. 1965–1972, Aug. 2013.
19. D. Xhindoli, S. Pacor, M. Benincasa, M. Scocchi, R. Gennaro, and A. Tossi, “The human cathelicidin LL-37 — A pore-forming antibacterial peptide and host-cell modulator,” Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr., vol. 1858, no. 3, pp. 546–566, Mar. 2016.